• Рязанский государственный медицинский университет
  • Астраханский государственный технический университет
  • Кубанский государственный аграрный университет
  • Оренбургский государственный университет
  • Пермский национальный исследовательский политехнический университет
  • Саратовский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского
  • Волжский университет имени В. Н. Татищева
  • Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники
  • Тюменский государственный архитектурно-строительный университет
  • Дальневосточный государственный университет путей сообщения
  • Нижегородский государственный университет имени Н. И. Лобачевского
  • Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова
Новости
27.11.2019
Подготовлен к печати сборник по итогам международной научно-практической конференции г. Пермь.
26.11.2019
Подготовлен к печати сборник по итогам международной научно-практической конференции г. Пермь.
26.11.2019
Подготовлен к печати сборник по итогам международной научно-практической конференции г. Пермь.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАКСИМАЛЬНОЙ ПЕРЕНОСИМОЙ ДОЗЫ МЕТИОНИН -ЛИАЗЫ У МЫШЕЙ С ЛИМФАДЕНОЗОМ ФИШЕРА L5178Y

Авторы:
Город:
Абакан
ВУЗ:
Дата:
25 мая 2017г.

Применение ферментных препаратов, необратимо разрушающих определенные аминокислоты, в онкологии, основано на метаболической специфичности некоторых опухолевых клеток, характерной особенностью которых является отсутствие или низкая активность синтетаз определенных аминокислот [1, 2]. Среди представителей этого класса наиболее известна L-аспарагиназа E. coli, которая применяется для лечения острых лимфобластных лейкозов уже более 30 лет [3-5]. В последние годы выделены и изучены L- аспарагиназы из новых источников [6-9], в том числе аспарагиназы, с улучшенными терапевтическими характеристиками: с пониженной глутаминазной активностью [10] или с повышенной стабильностью к расщеплению протеазами плазмы крови [11]; L-лизин-альфа-оксидаза Trichoderma cf. aureoviride Rifai [12], L-аргининдезиминаза [13] и др.

Метионин–γ-лиаза — пиридоксаль-5’-фосфат-зависимый фермент (МГЛ, КФ 4.4.1.11), катализирующий реакцию γ-элиминирования  L-метионина с образованием метилмеркаптана, α- кетомасляной кислоты и аммиака. Ранее были определены параметры стационарной кинетики МГЛ Clostridium sporogenes в реакции γ-элиминирования L-метионина, а также установлена ее четвертичная структура [14]. При изучении фармакокинетики МГЛ C. sporogenes у мышей показано, что после однократного введения 500 Ед/кг AUC0-inf составила 13,88±0,39 Ед/(мл×ч), а клиренс МГЛ C. sporogenes был лучше, чем у ближайших аналогов — МГЛ из C. tetani и C. freundii [15].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

определить максимальную переносимую дозу L-метионин–гамма-лиазы при терапии лимфаденоза Фишера

L5178y мышей при монотерапии и комбинированной терапии в сочетании с пиридоксином

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные: мыши-самки DBA2 разведения «РОНЦ им. Н.Н. Блохина».

Опухолевая модель. лимфаденоз Фишера L5178y — внутрибрюшинная трансплантация (в/б) по 106 клеток.

Препараты. МГЛ из C. sporogenes (выделена и очищена ФГУП ГосНИИГенетика), пиридоксинагидрохлорид, 50 мг/мл, ООО «Виал».

Дозы и режимы введения препаратов. МГЛ вводили в дозах от 4000 до 16000 в/б 9-кратно с интервалом 24 ч. Лечение начинали через 24 часа после трансплантации. Пиридоксин вводили в дозах 250 мг/кг в/б одновременно с МГЛ.

Оценка противоопухолевого эффекта. Эффективность лечения мышей оценивали по увеличению средней продолжительности жизни в группе (УПЖ). Значимой считали увеличение УПЖ >25%. Показатели эффективности определяли в сравнении c контролем.

Оценка переносимости. О переносимости лечения  судили по состоянию  и поведению мышей. Состояние животных визуально оценивали ежедневно. Павших или умерщвленных передозировкой эфирного наркоза мышей подвергали аутопсии для визуального определения патологических изменений внутренних органов. Фиксировали достоверное уменьшение массы тела (≥30%) и селезенки (косвенные признаки общей, гематологической и иммунотоксичности), а также гибель от токсичности. Сроки гибели леченных животных сравнивали с контрольной группой.

Статистическая обработка. Статистический анализ данных выполняли в среде пакета IBM SPSS Statistics 21. Сравнения выполняли с помощью одно- и двухфакторного дисперсионного анализа, попарные сравнения групп по критерию Тьюки. В работе приведены среднее и среднеквадратическое отклонение (M±s). Различия считали статистически значимыми при p ≤0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Во всех изученных дозовых режимах терапия лимфаденоза Фишера L5178у с МГЛ Cl. sporogenes не выявила достоверного противоопухолевого эффекта (табл. 1).

Таблица 1. Сроки гибели мышей после лечения с применением МГЛ

 

Доза МГЛ, Е/кг

Доза пиридоксина,

мг/кг

Сутки гибели после

трансплантации

СПЖ

нет

нет

21, 21, 16, 21, 17, 22

19,7

нет

250

21, 19, 21, 21, 23, 22

21, 2

4000

нет

10, 12, 15, 10, 11, 12

11,6

4000

250

10, 10, 10, 11

10,2

8000

нет

10, 10, 12, 13, 14

11,8

8000

250

10, 14, 10, 15, 18, 18

14,2

16000

нет

5, 6, 5, 6, 4, 8

5,5

 

Комбинированная терапия в сочетании с пиридоксином в дозах 4000 и 8000 также не показала эффективности. При разовых дозах выше 4000 Е/кг, как в схемах лечения с пиридоксином, так и без него была получена выраженная токсичность с гибелью с 5 по 18-е сутки. Так, в группе мышей, получивших МГЛ в дозе 16000 Е/кг, гибель наблюдалась после 4 введения, все мыши пали  на 4-8-е сутки после трансплантации при явлениях выраженной адинамии, снижения массы тела (>20% по сравнению с исходным уровнем), на аутопсии были выявлены признаки выраженной гепатотоксичности и перитонита, проявляющиеся в большом количестве асцита и гангренозном гепатите с большим количеством кровоизлияний. В группе мышей, получивших МГЛ в дозе 4000 8000 Е/кг (как в монорежиме, так и в сочетании с пиридоксином), животные погибали на 10-18-е сутки после трансплантации (после 8 введений), при аналогичных признаках токсичности.

Таким образом, увеличение дозы от 4000 Е/кг в/б многократно приводило к гибели животных. Ранее определённая в эксперименте на меланоме В16 максимальная переносимая доза МГЛ C. sporogenes при многократном в/б введении с интервалом 24 ч, использованная для последующих экспериментов, составила 2000 Е/кг, до 10 введений. Введение пиридоксина не усугубляло токсичности МГЛ (р=0,129).

ВЫВОДЫ

Лимфаденоз Фишера L5178y не обладает чувствительностью к терапии препаратами МГЛ из C. sporogenes. Разовые дозы МГЛ 4000 Е/кг и выше при многократном введении вызывают гибель мышей. Максимальная разовая переносимая доза МГЛ для мышей DBA2 — менее 2000 Е/кг при многократном введении. Дополнительное введение пиридоксина при комбинированной терапии не усугубляет токсичность МГЛ.

 

Список литературы

 

1. Покровский В.С., Лесная Н.А., Трещалина Е.М., Лукашева Е.В., Березов Т.Т. Перспективы разработки новых ферментных противоопухолевых препаратов / Вопросы онкологии. 2011. Т. 57. № 2. С. 155-164.

2. Покровский В.С., Трещалина Е.М. Ферментные препараты в онкогематологии: актуальные направления  экспериментальных  исследований  и  перспективы  клинического  применения  / Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. 2014. Т. 7. № 1. С. 28-38.

3. Egler RA, Ahuja SP, Matloub Y. L-asparaginase in the treatment of patients with acute lymphoblastic leukemia / J Pharmacol Pharmacother. 2016. Vol. 7(2). P. 62-71.

4. Pokrovskaya M.V., Aleksandrova S.S., Pokrovsky V.S. et al. Identification of functional regions in the Rhodospirillum rubrum L-asparaginase by site-directed mutagenesis / Molecular Biotechnology. 2015. Т. 57. № 3. С. 251-264.

5. Pokrovsky V.S., Pokrovskaya M.V., Aleksandrova S.S., Kazanov M.D., Dyakov I.N. Comparative immunogenicity and structural analysis of epitopes of different bacterial L-asparaginases / BMC Cancer. 2016. Т. 16. № 1. С. 89.

6. Sidoruk K.V., Bogush V.G., Pokrovsky V.S. et al. Creation of a producent, optimization of expression, and purifiсation of recombinant Yersinia pseudotuberculosis L-asparaginase / Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2011. Т. 152. № 2. С. 219-223.

7.   Покровская М.В., Покровский В.С., Александрова С.С., и др. Рекомбинантная внутриклеточная L-аспарагиназа Rhodospirillum rubrum с низкой L-глутаминазной активностью и антипролиферативным эффектом / Биомедицинская химия. 2013. Т. 59. № 2. С. 192-208.

8.     Покровская М.В., Покровский В.С., Соколов Н.Н. Дифференциальная среда для выявления штаммов бактерий-продуцентов L-аспарагиназ / Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 2. С. 183-186.

9. Покровский В.С., Покровская М.В., Александрова С.С. и др. Физико-химические свойства и антипролиферативная активность рекомбинантной L-аспарагиназы Yersinia pseudotuberculosis / Прикладная биохимия и микробиология. 2013. Т. 49. № 1. С. 24.

10.   Pokrovskaya M.V., Pokrovskiy V.S., Aleksandrova S.S. et al. Recombinant intracellular Rhodospirillum rubrum L-asparaginase with low L-glutaminase activity and antiproliferative effect / Biochemistry (Moscow) Supplement. Series B: Biomedical Chemistry. 2012. Т. 6. № 2. С. 123-131.

11.   Sannikova E.P., Bulushova N.V., Cheperegin S.E. et al. The modified heparin-binding L-asparaginase of Wolinella succinogenes / Molecular Biotechnology. 2016. Т. 58. № 8-9. С. 528-539.

12.   Pokrovsky V.S., Treshalina H.M., Sedakova L.A., et al. Enzymatic properties and anticancer activity ofl-lysine α-oxidase from Trichoderma cf. aureoviride rifai BKMF-4268D / Anti-Cancer Drugs. 2013. Т.24. № 8. С. 846-851.

13.   Han RZ, Xu GC, Dong JJ, Ni Y. Arginine deiminase: recent advances in discovery, crystal structure, and protein engineering for improved properties as an anti-tumor drug /Appl Microbiol Biotechnol. 2016 Vol. 100(11) P. 4747-60.

14.   Морозова Е.А., Куликова В.В., Яшин Д.В. и др. Кинетические характеристики и цитотоксическая активность рекомбинантных препаратов метионин–γ-лиазы Сlostridium tetani, Clostridium sporogenes, Porphyromonas gingivalis и Citrobacter freundii / Acta Naturae. 2013. Т. 5. № 3 (18). С. 96-102.

15.   Morozova E.A., Anufrieva N.V., Davydov D.Z. et al. Plasma methionine depletion and pharmacokinetic properties in mice of methionine γ-lyase from Citrobacter freundii, Clostridium tetani and Clostridium sporogenes / Biomed Pharmacother. 2017 Vol 88. P. 978-984. doi: 10.1016/j.biopha.2017.01.127